Equipe Thématique de recherche Publications
Responsable : Valérie THIERS
France DEMAUGRE
Alexandre DOS SANTOS
Sokhavuth SAR
Les carcinomes hépatocellulaires ainsi que les cholangiocarcinomes dont l'incidence augmente dans les pays occidentaux depuis une vingtaine d'années se développent le plus souvent sur un tissu hépatique dont l'architecture est très remaniée. Une réaction fibreuse notable enchasse dans la plupart des cas les lésions tumorales compliquant l'analyse fine des modifications du protéome des cholangiocytes ou des hépatocytes tumoraux ce qui gène l'identification de protéines qui pourraient être des marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques pour ces pathologies qui sont de pronostic sombre.
Nous avons recherché si la microdissection laser qui permet de sélectionner des cellules ou des groupes de cellules d'intérêt dans un fragment tissulaire hétérogène était un outil performant pour la détermination des modifications du protéome dans de tels cancers.
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| Microdissection de cellules tumorales (PALM Microlaser objectif 40) |
Les méthodologies utilisées pour cette étude comportaient la 2D-PAGE pour l'établissement de la carte des protéines exprimées et la spectrométrie de masse (MALDI-TOF) pour l'identification des proteines.
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Flowchart de l'analyse quantitative et qualitative par spectrométrie de masse directe |
Nous avons ainsi montré, en utilisant comme modèle le carcinome hépatocellulaire développé sur cirrhose chez des patients infectés par le virus de l'hépatite C, que les modifications du protéome hépatocytaire présentes dans la tumeur sont déterminées avec plus de précisions et qu'un plus grand nombre d'altérations est identifié quand l'étude est réalisée sur des populations hépatocytaires enrichies grâce à la microdissection. En effet lorsque l'étude utilise des fragments tissulaires non sélectionnés on investigue non seulement le proteome hépatocytaire mais aussi celui du stroma fibreux (cellules inflammatoires, fibroblastes) que nous avons montré être très différent de celui des hépatocytes (Dos Santos et al. Proteomics Clin. App. 2007).
Si le carcinome hépatocellulaire est généralement une tumeur compacte, il n'en est pas de même pour le cholangiocarcinome qui touche les cellules biliaires : de petits groupes de cellules tumorales sont dispersés dans un stroma fibrotique abondant. La microdissection des cholangiocytes tumoraux donc est indispensable si on veut étudier avec précision le protéome de ces cellules. L'analyse est réalisée en utilisant directement la spectrométrie de masse par LC-MS/MS (nanoLC-FTICR). Cette étape est réalisée en collaboration avec le groupe de J. Garin à Grenoble (INSERM U880).
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Validation par immunohistochimie de deux protéines retrouvées différentiellement exprimées |
Environ 350 protéines ont été identifiées puis quantifiées par cette technologie. Près de quarante protéines ont été retrouvés différentiellement exprimés entre les cholangiocytes tumoraux et non tumoraux ; on retrouve des protéines impliquées dans la signalisation du TGF-beta et dans la transition Epithelium-Mesenchyme (EMT). La validation des données acquises au cours de ce projet est réalisée en utilisant les méthodes de Western-blot et d'immunohistochimie sur des tissus-arrays.